摘要：波蘭弗羅茨瓦夫大學團隊利用鏈霉菌模型開展SMC對ParB動態(tài)行為與功能調(diào)控的主題研究。
在細菌細胞中，染色體分離是保證遺傳信息準確傳遞的核心生物學過程。這一過程主要由ParABS系統(tǒng)介導，其中ParB蛋白作為關(guān)鍵組分，通過結(jié)合特異的parS位點形成大型核蛋白復合體（稱為segrosome），進而招募結(jié)構(gòu)維持染色體（Structural Maintenance of Chromosomes, SMC）蛋白復合物來協(xié)調(diào)染色體的高級組織與分離。近年來研究發(fā)現(xiàn)ParB具有CTP酶活性，其通過CTP結(jié)合與水解循環(huán)調(diào)控自身與DNA的相互作用——CTP結(jié)合的ParB二聚體在parS位點成核后發(fā)生構(gòu)象變化形成閉合鉗結(jié)構(gòu)，并沿DNA滑動實現(xiàn)擴散，而CTP水解則促使ParB從DNA解離。然而，SMC復合體作為ParB的重要招募對象，是否以及如何反饋調(diào)節(jié)ParB復合體的動態(tài)特性與功能，長期以來仍不明確。
針對該問題，弗羅茨瓦夫大學的Katarzyna Pawlikiewicz等研究人員以模式生物委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）為對象，通過構(gòu)建ParB-HaloTag（ParB-HT）融合蛋白菌株，結(jié)合時間推移熒光顯微鏡、單分子追蹤（SMT）、熒光恢復后漂白（FRAP）及染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）等多學科技術(shù)，系統(tǒng)探究了SMC存在與否對ParB動態(tài)行為、DNA結(jié)合特性及酶活性的影響。該研究論文已于2025年發(fā)表在《Nature Communications》期刊。
圖1 SMC調(diào)控鏈霉菌中分離復合體內(nèi)ParB的結(jié)合
研究主要依托以下關(guān)鍵技術(shù)方法：首先利用微生物遺傳學手段構(gòu)建了ParB-HT標簽菌株及SMC敲除株（△smc），通過時間序列顯微成像分析孢子形成過程中ParB復合體的動態(tài)變化；應(yīng)用單分子追蹤分析ParB蛋白的擴散運動；采用ChIP-seq在全基因組范圍檢測ParB與DNA的結(jié)合模式；并通過體外CTP水解實驗量化SMC對ParB酶活性的調(diào)控。所有實驗均設(shè)置野生型與突變體對照，樣本來源于同步培養(yǎng)的鏈霉菌液體培養(yǎng)物。
研究結(jié)果主要包括以下方面：
The dynamics of ParB complexes in sporogenic cells
通過時間序列成像觀察發(fā)現(xiàn)，在孢子形成細胞中，ParB-HT復合體在菌絲生長停止后27±10分鐘（T1）開始呈現(xiàn)規(guī)則排列，隨后在80分鐘左右逐漸解離。該過程與細胞分裂蛋白FtsZ形成的Z環(huán)出現(xiàn)與消失時間高度同步，表明ParB復合體在孢子形成期中短暫存在，并于細胞分裂時發(fā)生解離。
Elimination of SMC promotes disassembly of ParB-HT complexes in sporogenic cells
在SMC缺失菌株（△smc）中，ParB復合體規(guī)則排列的出現(xiàn)時間略早于野生型（20±9分鐘），但其解離時間顯著提前（79±25分鐘 vs 野生型114±42分鐘），且存在時間變異性降低。此外，SMC缺失還導致隔膜形成延遲和孢子成型時間略微延長。Western blotting排除了ParB蛋白水平變化的影響，表明SMC確實具有穩(wěn)定ParB復合體的作用。
圖2 SMC的加載對ParB復合體組裝產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)
Elimination of SMC lowers mobility of ParB molecules
單分子追蹤顯示，在孢子形成早期（17小時），SMC缺失并未改變ParB的移動性；但在晚期（22小時），△smc菌株中ParB的平均擴散系數(shù)顯著降低（0.045μm2/s vs 野生型0.106μm2/s），且固定分子比例升高（62% vs 41.5%）。在幼齡營養(yǎng)菌絲中，SMC缺失同樣導致ParB移動性下降和固定分子分布分散化，提示SMC缺失可能增強了ParB與非特異性DNA的結(jié)合。
The absence of SMC increases the turnover of ParB-HT in the apical complex FRAP實驗表明，盡管SMC缺失菌株與野生型均呈現(xiàn)約60%的熒光恢復率，但前者恢復半衰期（tau）顯著縮短（135±72秒 vs 222±200秒），說明SMC缺失環(huán)境下ParB復合體具有更快的周轉(zhuǎn)速率，與前述復合體穩(wěn)定性下降的結(jié)果一致。
SMC promotes ParB spreading at parS sites
ChIP-seq分析揭示，在野生型中ParB結(jié)合于16個已知parS位點及1個新位點，并在其上下游延伸2.5–3 kb，表現(xiàn)出典型的擴散特征。而在△smc菌株中，ParB在parS位點的結(jié)合信號減弱至野生型的一半，擴散現(xiàn)象幾乎消失，但全染色體范圍內(nèi)的非特異性結(jié)合反而增加。這表明SMC是ParB特異性結(jié)合parS并實現(xiàn)擴散的關(guān)鍵促進因子。
SMC reduces ParB CTPase activity
體外酶活實驗表明，在parS質(zhì)粒存在下，SMC的添加使ParB的CTP水解活性從65.1±2.9 μmol/μmol/h降至35.2±5.2 μmol/μmol/h。利用蛋白互作界面突變體ParBSMC-（TDR132-134→AAT及D164R）進一步驗證發(fā)現(xiàn)，該突變體本身酶活性降低，且SMC對其活性的抑制作用顯著減弱，說明SMC對ParB CTP酶活的抑制依賴于二者間的直接相互作用。
研究最終得出結(jié)論：SMC通過直接相互作用抑制ParB的CTP水解活性，從而穩(wěn)定其閉合鉗構(gòu)象，促進ParB在parS位點的加載與沿DNA的擴散，增強segrosome的穩(wěn)定性。這一正反饋調(diào)控機制對于孢子形成期染色體的高效分離具有關(guān)鍵作用。同時，該研究揭示了SMC-ParB互作在細菌染色體組織中的核心地位，為理解ParABS系統(tǒng)與SMC協(xié)同工作機制提供了重要理論依據(jù)。
參考資料
[1] SMC modulates ParB engagement in segregation complexes in streptomyces
摘要：波蘭弗羅茨瓦夫大學團隊利用鏈霉菌模型開展SMC對ParB動態(tài)行為與功能調(diào)控的主題研究。
在細菌細胞中，染色體分離是保證遺傳信息準確傳遞的核心生物學過程。這一過程主要由ParABS系統(tǒng)介導，其中ParB蛋白作為關(guān)鍵組分，通過結(jié)合特異的parS位點形成大型核蛋白復合體（稱為segrosome），進而招募結(jié)構(gòu)維持染色體（Structural Maintenance of Chromosomes, SMC）蛋白復合物來協(xié)調(diào)染色體的高級組織與分離。近年來研究發(fā)現(xiàn)ParB具有CTP酶活性，其通過CTP結(jié)合與水解循環(huán)調(diào)控自身與DNA的相互作用——CTP結(jié)合的ParB二聚體在parS位點成核后發(fā)生構(gòu)象變化形成閉合鉗結(jié)構(gòu)，并沿DNA滑動實現(xiàn)擴散，而CTP水解則促使ParB從DNA解離。然而，SMC復合體作為ParB的重要招募對象，是否以及如何反饋調(diào)節(jié)ParB復合體的動態(tài)特性與功能，長期以來仍不明確。
針對該問題，弗羅茨瓦夫大學的Katarzyna Pawlikiewicz等研究人員以模式生物委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）為對象，通過構(gòu)建ParB-HaloTag（ParB-HT）融合蛋白菌株，結(jié)合時間推移熒光顯微鏡、單分子追蹤（SMT）、熒光恢復后漂白（FRAP）及染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）等多學科技術(shù)，系統(tǒng)探究了SMC存在與否對ParB動態(tài)行為、DNA結(jié)合特性及酶活性的影響。該研究論文已于2025年發(fā)表在《Nature Communications》期刊。
圖1 SMC調(diào)控鏈霉菌中分離復合體內(nèi)ParB的結(jié)合
研究主要依托以下關(guān)鍵技術(shù)方法：首先利用微生物遺傳學手段構(gòu)建了ParB-HT標簽菌株及SMC敲除株（△smc），通過時間序列顯微成像分析孢子形成過程中ParB復合體的動態(tài)變化；應(yīng)用單分子追蹤分析ParB蛋白的擴散運動；采用ChIP-seq在全基因組范圍檢測ParB與DNA的結(jié)合模式；并通過體外CTP水解實驗量化SMC對ParB酶活性的調(diào)控。所有實驗均設(shè)置野生型與突變體對照，樣本來源于同步培養(yǎng)的鏈霉菌液體培養(yǎng)物。
研究結(jié)果主要包括以下方面：
The dynamics of ParB complexes in sporogenic cells
通過時間序列成像觀察發(fā)現(xiàn)，在孢子形成細胞中，ParB-HT復合體在菌絲生長停止后27±10分鐘（T1）開始呈現(xiàn)規(guī)則排列，隨后在80分鐘左右逐漸解離。該過程與細胞分裂蛋白FtsZ形成的Z環(huán)出現(xiàn)與消失時間高度同步，表明ParB復合體在孢子形成期中短暫存在，并于細胞分裂時發(fā)生解離。
Elimination of SMC promotes disassembly of ParB-HT complexes in sporogenic cells
在SMC缺失菌株（△smc）中，ParB復合體規(guī)則排列的出現(xiàn)時間略早于野生型（20±9分鐘），但其解離時間顯著提前（79±25分鐘 vs 野生型114±42分鐘），且存在時間變異性降低。此外，SMC缺失還導致隔膜形成延遲和孢子成型時間略微延長。Western blotting排除了ParB蛋白水平變化的影響，表明SMC確實具有穩(wěn)定ParB復合體的作用。
圖2 SMC的加載對ParB復合體組裝產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)
Elimination of SMC lowers mobility of ParB molecules
單分子追蹤顯示，在孢子形成早期（17小時），SMC缺失并未改變ParB的移動性；但在晚期（22小時），△smc菌株中ParB的平均擴散系數(shù)顯著降低（0.045μm2/s vs 野生型0.106μm2/s），且固定分子比例升高（62% vs 41.5%）。在幼齡營養(yǎng)菌絲中，SMC缺失同樣導致ParB移動性下降和固定分子分布分散化，提示SMC缺失可能增強了ParB與非特異性DNA的結(jié)合。
The absence of SMC increases the turnover of ParB-HT in the apical complex FRAP實驗表明，盡管SMC缺失菌株與野生型均呈現(xiàn)約60%的熒光恢復率，但前者恢復半衰期（tau）顯著縮短（135±72秒 vs 222±200秒），說明SMC缺失環(huán)境下ParB復合體具有更快的周轉(zhuǎn)速率，與前述復合體穩(wěn)定性下降的結(jié)果一致。
SMC promotes ParB spreading at parS sites
ChIP-seq分析揭示，在野生型中ParB結(jié)合于16個已知parS位點及1個新位點，并在其上下游延伸2.5–3 kb，表現(xiàn)出典型的擴散特征。而在△smc菌株中，ParB在parS位點的結(jié)合信號減弱至野生型的一半，擴散現(xiàn)象幾乎消失，但全染色體范圍內(nèi)的非特異性結(jié)合反而增加。這表明SMC是ParB特異性結(jié)合parS并實現(xiàn)擴散的關(guān)鍵促進因子。
SMC reduces ParB CTPase activity
體外酶活實驗表明，在parS質(zhì)粒存在下，SMC的添加使ParB的CTP水解活性從65.1±2.9 μmol/μmol/h降至35.2±5.2 μmol/μmol/h。利用蛋白互作界面突變體ParBSMC-（TDR132-134→AAT及D164R）進一步驗證發(fā)現(xiàn)，該突變體本身酶活性降低，且SMC對其活性的抑制作用顯著減弱，說明SMC對ParB CTP酶活的抑制依賴于二者間的直接相互作用。
研究最終得出結(jié)論：SMC通過直接相互作用抑制ParB的CTP水解活性，從而穩(wěn)定其閉合鉗構(gòu)象，促進ParB在parS位點的加載與沿DNA的擴散，增強segrosome的穩(wěn)定性。這一正反饋調(diào)控機制對于孢子形成期染色體的高效分離具有關(guān)鍵作用。同時，該研究揭示了SMC-ParB互作在細菌染色體組織中的核心地位，為理解ParABS系統(tǒng)與SMC協(xié)同工作機制提供了重要理論依據(jù)。
參考資料
[1] SMC modulates ParB engagement in segregation complexes in streptomyces
