摘要：本研究揭示了核苷酸代謝失衡導(dǎo)致核糖核苷酸誤摻入線粒體DNA，引發(fā)mtDNA片段釋放至胞質(zhì)。

代謝紊亂與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但核苷酸缺乏如何驅(qū)動(dòng)線粒體DNA（mtDNA）依賴性炎癥的具體機(jī)制尚未明確。線粒體作為細(xì)胞能量工廠和信號(hào)樞紐，其功能異常會(huì)引發(fā)炎癥、細(xì)胞死亡和疾病。多種應(yīng)激因素（如病原體感染、mtDNA包裝缺陷、嘧啶代謝障礙等）可導(dǎo)致mtDNA釋放到胞質(zhì)，通過(guò)cGAS-STING-TBK1信號(hào)通路激活I(lǐng)型干擾素和干擾素刺激基因（ISGs）表達(dá)。這一反應(yīng)雖有助于抗病原體防御，但過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)自身免疫病、炎癥性疾病及衰老進(jìn)程。

近期研究表明，線粒體蛋白酶YME1L通過(guò)重塑線粒體蛋白質(zhì)組響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激，支持回補(bǔ)反應(yīng)和嘧啶代謝，對(duì)某些實(shí)體瘤生長(zhǎng)和成體神經(jīng)干細(xì)胞維持至關(guān)重要。YME1L缺失或化療藥物抑制胞質(zhì)嘧啶合成會(huì)引發(fā)核苷酸失衡，導(dǎo)致mtDNA釋放和炎癥。然而，核苷酸失衡或其他線粒體應(yīng)激源影響mtDNA并導(dǎo)致其釋放的具體機(jī)制仍不清楚。

 圖1 核糖核苷酸摻入線粒體DNA驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)

本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，缺乏線粒體核酸酶MGME1的小鼠（Mgme1^-/-）在約1歲時(shí)出現(xiàn)腎臟炎癥并過(guò)早死于腎衰竭。為探究線粒體依賴性先天免疫信號(hào)是否參與該表型，研究人員監(jiān)測(cè)了不同年齡野生型（WT）和Mgme1^-/-小鼠腎臟中ISGs的mRNA水平。結(jié)果顯示，隨著衰老進(jìn)程，Mgme1^-/-小鼠ISG表達(dá)逐漸誘導(dǎo)，70周齡時(shí)達(dá)到最高。該反應(yīng)具有組織特異性，在55周齡Mgme1^-/-小鼠的脾臟、心臟、肝臟或腦組織中未觀察到類似現(xiàn)象。

通過(guò)分離55周齡小鼠腎臟線粒體和胞質(zhì)組分，并采用針對(duì)mtDNA控制區(qū)、大弧和小弧的特異性探針進(jìn)行數(shù)字PCR（dPCR）分析，發(fā)現(xiàn)Mgme1^-/-腎臟胞質(zhì)中存在mtDNA，且這些片段主要富集于重鏈復(fù)制起點(diǎn)（OH）附近區(qū)域。肝臟胞質(zhì)中也可檢測(cè)到mtDNA片段，但水平較低，與肝臟缺乏炎癥的現(xiàn)象一致。這可能是因?yàn)?'修復(fù)核酸酶1（TREX1）等胞質(zhì)DNA清除機(jī)制在低水平mtDNA釋放時(shí)足以預(yù)防天然免疫反應(yīng)激活。

為驗(yàn)證胞質(zhì)mtDNA片段是否通過(guò)cGAS-STING-TBK1信號(hào)通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)，研究人員將Mgme1^-/-小鼠與攜帶功能缺失突變Sting1mut/mut（編碼STING）的小鼠雜交，獲得雙敲除（DKO）小鼠。55周齡Mgme1^-/-小鼠腎臟中強(qiáng)烈的ISG反應(yīng)在STING缺失后顯著減弱，表明STING在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。組織學(xué)分析顯示，STING消融改善了Mgme1^-/-小鼠的腎臟表型，包括腎小球硬化、蛋白管型形成及B220+和CD3+T細(xì)胞的腎周浸潤(rùn)。

在細(xì)胞模型中，Mgme1^-/-原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）表現(xiàn)出顯著ISG反應(yīng)，STING1缺失后該反應(yīng)被強(qiáng)烈抑制。消耗cGAS或STING，或用BX795抑制TBK1，可抑制永生化Mgme1^-/-細(xì)胞中ISG表達(dá)，而RNA傳感器的缺失無(wú)此效應(yīng)。此外，基礎(chǔ)條件下主要位于核內(nèi)的cGAS在Mgme1^-/-細(xì)胞胞質(zhì)中積累。數(shù)字液滴PCR（ddPCR）和細(xì)胞分餾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到Mgme1^-/- MEFs胞質(zhì)mtDNA水平增加，免疫熒光顯微鏡顯示胞質(zhì)DNA焦點(diǎn)數(shù)量和細(xì)胞比例升高。用鏈終止核苷酸類似物2',3'-雙脫氧胞苷（ddC）消耗mtDNA后，MGME1缺失或Mgme1缺陷細(xì)胞中的天然免疫信號(hào)被抑制。這些實(shí)驗(yàn)證明MGME1缺失導(dǎo)致mtDNA釋放到胞質(zhì)，激活cGAS-STING-TBK1信號(hào)和ISGs表達(dá)。

由于MGME1作為線粒體復(fù)制核酸酶的功能，研究人員推測(cè)受損的mtDNA復(fù)制可能觸發(fā)mtDNA依賴性免疫反應(yīng)。但與其他mtDNA復(fù)制酶（如Polrmt、Rnasch1）缺失不同，Mgme1^-/-細(xì)胞中ISG反應(yīng)依然存在。相反，消耗解旋酶Twinkle或Ssbp1可抑制Mgme1^-/-細(xì)胞中的ISG反應(yīng)，表明持續(xù)的mtDNA合成是觸發(fā)mtDNA釋放所必需的。

對(duì)Mgme1^-/-小鼠腎臟mtDNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)隨距離OH增加，序列覆蓋率下降，與之前腦和心臟組織中的復(fù)制停滯表型一致。深度測(cè)序分析提示Mgme1^-/-腎臟中從OH起始的mtDNA復(fù)制事件增多，這可能解釋mtDNA依賴性炎癥的組織特異性。增加的復(fù)制起始可能導(dǎo)致脫氧核苷酸池耗竭，引起細(xì)胞核苷酸失衡和mtDNA依賴性天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)。

通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析Mgme1^-/-細(xì)胞核苷酸水平，發(fā)現(xiàn)脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）降低，核糖核苷酸單磷酸（rNMPs）顯著增加。消耗SAMHD1（一種脫氧核苷酸三磷酸三磷酸水解酶）可恢復(fù)dNTP水平并抑制ISG反應(yīng)。消耗線粒體嘧啶核苷酸載體SLC25A33（支持mtDNA復(fù)制的嘧啶核苷酸線粒體攝取載體）也可降低Mgme1^-/-細(xì)胞中的ISG表達(dá)。這些結(jié)果表明，核苷酸代謝紊亂 combined with altered mtDNA replication triggers mtDNA release and cGAS-STING-TBK1 signalling in Mgme1^-/- cells.

研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Mgme1^-/-細(xì)胞中核糖核苷酸三磷酸（rNTP）與dNTP的比率升高。YME1L缺失和用5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制胞質(zhì)胸苷酸合酶（均已知可觸發(fā)mtDNA依賴性天然免疫信號(hào)）也增加rNTP/dNTP比率。真核細(xì)胞中rNTP相對(duì)于dNTP過(guò)量存在，盡管復(fù)制聚合酶對(duì)dNTP高度選擇，但rNTP的錯(cuò)誤摻入可能挑戰(zhàn)DNA復(fù)制，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、基因組不穩(wěn)定和自身免疫疾病。核糖核苷酸切除修復(fù)（涉及RNase H2）限制了核DNA中的rNMP含量，但線粒體中缺乏清除核糖核苷酸的機(jī)制，使mtDNA易受rNTP摻入影響。

通過(guò)水解末端測(cè)序（HydEn-seq）和堿性凝膠電泳分析，直接定量了WT和Yme1l^-/-細(xì)胞mtDNA中的rNMP含量。結(jié)果顯示Yme1l^-/-細(xì)胞重鏈中鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸相對(duì)增加。堿性條件下，Yme1l^-/-細(xì)胞mtDNA顯示不同的降解模式和更短DNA片段形成，表明對(duì)堿性的敏感性增加，提示rNTP摻入增多。Mgme1^-/-細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象，重鏈中鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸水平顯著更高，輕鏈中胞苷核糖核苷酸插入增加，兩條鏈中腺苷核糖核苷酸摻入減少。55周齡Mgme1^-/-小鼠腎臟mtDNA對(duì)堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明體內(nèi)mtDNA rNMP含量升高。

在細(xì)胞衰老模型中，研究人員用羥基脲（HU）（胞質(zhì)核糖核苷酸還原酶（RNR）的有效抑制劑）處理WT細(xì)胞，也觀察到mtDNA rNMP含量增加。RNR由兩個(gè)非同源亞基RRM1和RRM2組成，RRM2表達(dá)呈細(xì)胞周期依賴性，在細(xì)胞周期停滯的衰老細(xì)胞中停止，導(dǎo)致dNTP水平降低。由于mtDNA釋放有助于衰老細(xì)胞的促炎SASP，且mtDNA復(fù)制與細(xì)胞周期無(wú)關(guān)，研究人員推測(cè)改變的rNTP/dNTP比率和增加的rNTP摻入mtDNA可能觸發(fā)衰老細(xì)胞中的mtDNA釋放和SASP。

通過(guò)電離輻射（IR）或治療誘導(dǎo)衰老（TIS）處理人肺IMR90成纖維細(xì)胞，研究人員證實(shí)衰老狀態(tài)的建立（通過(guò)SA-β-gal活性和衰老相關(guān)蛋白標(biāo)志物變化驗(yàn)證）。代謝組學(xué)分析顯示IR或TIS后rNTP/dNTP比率增加。堿性凝膠電泳分析顯示IR處理后衰老細(xì)胞mtDNA對(duì)堿性和RNase H2處理敏感性增加，表明這些細(xì)胞mtDNA的rNMP含量更高。在地西他濱或多柔比星處理的衰老IMR90成纖維細(xì)胞及照射后的腎近端小管上皮細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象。

為驗(yàn)證mtDNA rNMP含量增加是否影響mtDNA釋放和SASP，研究人員用脫氧核糖核苷補(bǔ)充衰老細(xì)胞。脫氧核糖核苷補(bǔ)充不影響衰老狀態(tài)本身，但顯著減少胞質(zhì)mtDNA和mtDNA對(duì)堿及RNase H2處理的敏感性，表明rNMP含量降低。dNTP補(bǔ)充衰老細(xì)胞后，rNTP摻入減少，炎癥性SASP基因表達(dá)被抑制。這表明SASP基因表達(dá)依賴于衰老細(xì)胞mtDNA中rNTP摻入的增加。

在自然衰老過(guò)程中，研究人員對(duì)老年小鼠腎臟、肝臟、心臟和脾臟進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)所有組織中rNTP/dNTP比率均增加，且對(duì)不同核苷酸有多樣化影響。從這些組織分離的mtDNA對(duì)堿性和RNase H2處理的敏感性較年輕小鼠增加，證明老年組織中rNTP摻入增加。

本研究使用的主要技術(shù)方法包括：基因敲除小鼠模型構(gòu)建、細(xì)胞分餾和數(shù)字PCR（dPCR/ddPCR）檢測(cè)胞質(zhì)mtDNA、RNA干擾技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析核苷酸水平、水解末端測(cè)序（HydEn-seq）檢測(cè)mtDNA中核糖核苷酸摻入、堿性凝膠電泳和Southern blot分析、體外復(fù)制 assays 使用重組蛋白、納米字符串（NanoString）技術(shù)分析ISG表達(dá)譜、免疫組化和免疫熒光分析。樣本來(lái)源包括：Mgme1^-/-小鼠腎臟、肝臟等組織，原代和永生化MEF細(xì)胞，人肺成纖維細(xì)胞IMR90，以及衰老模型細(xì)胞。

本研究結(jié)論表明，核苷酸代謝失衡導(dǎo)致rNTP誤摻入mtDNA，引起mtDNA鏈斷裂和片段釋放，激活cGAS-STING依賴的炎癥反應(yīng)和SASP。這不僅解釋了Mgme1^-/-小鼠年齡依賴性腎炎癥的機(jī)制，也為線粒體疾?。ㄈ鏡RM2B突變引起的mtDNA耗竭綜合征）中的炎癥反應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)。老年組織中mtDNA rNMP含量增加進(jìn)一步支持了mtDNA在自然衰老過(guò)程中促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)治療年齡相關(guān)炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥具有深遠(yuǎn)意義。

該研究由德國(guó)馬克斯·普朗克衰老生物學(xué)研究所、哥德堡大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所、劍橋大學(xué)MRC線粒體生物學(xué)單元、卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與生物物理學(xué)系、弗萊堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心外科病理學(xué)研究所、科隆大學(xué)CECAD應(yīng)激反應(yīng)卓越集群等機(jī)構(gòu)合作完成，發(fā)表于《Nature》期刊。

[1] Ribonucleotide incorporation into mitochondrial DNA drives inflammation